免疫沈降法

ある特定のタンパク質と結合するものを細胞破砕液中から見つけ出す。

baitにはhisタグがついている。
タグ配列を特異的に認識する抗体
抗体の非可変部であるFcに結合するproteinA,Gにアガロースビーズをつけておく。
これにより、baitとpreyが結合するとアガロースビーズの重さで沈む。
※抗原決定基
HAtag
c-Myc tag
Flag tag
※免疫沈降法はファージを用いたスクリーニング等である程度preyを絞ってから使う。

・baitにc-Myc tag、preyにFlag tag をそれぞれ配列したプラスミドを作る。
↓
細胞に入れる
↓
細胞を破砕
↓
免疫沈降後、Western blottingを行う。

・Far Western
特異的な抗体の替わりに、baitタンパク質をプローブとして使用。
※質量しかわからない。

・細胞破砕液→SDS-PAGE→ビオチン化したbaitタンパク質を加え、アビジンと架橋させたHRP(horse radish peroxidase)またはAP(alkaliphosphatase)を添加後、基質と反応させる。